풀림DNA Polymerase actio n염기의 조합 오류 등 원핵세포로부터 DNA 합성_양방향 복제(Bidirectional replication) 반저장적 복제 DNA

 * DNA 복제 메커니즘의 기본 특징은 박테리아 E.coli에서 일어나는 과정으로 묘사된다. 이 바실러스는 몸 속 결장에서 공생적으로 사는 미생물이다.

쌍방향 복제(Bidirectional Replication) E. coli 염색체의 원형이중쇄 DNA 복제는 ‘복제의 (origin of replication)’으로 알려진 단일 개시지점에서 약 30개의 단백질 DnaA가 붙어서 시작된다.

복제는 point of origin(oriC)으로 시작되어, 양방향 동시에 진행된다. Parental 은 진한 파란색이고 새로 생성된 은 하늘색으로 표시된다.다른 단백질(예를 들어 helicase, gyrase, 단일 사슬 결합 단백질 등)의 도움을 받아 두 개의 parental strand(이하 부모형이라 할 수 있다.이 지점내에서 분리되어 2개는 동시에 복사된다. 합성은 origin 부분에서 시작되어 본체로부터 쌍방향으로 떨어져 나가는 두 개의 복제 분기점(replication forks)에서 일어난다. 복제는 종결지점의 염색체 다른 쪽에서 끝난다. 새로운 DNA 한 개당 400만 개가 넘는 뉴클레오티드 합성 한 바퀴는 약 40분 후에 완성된다. 그러나 합성의 두 번째 라운드는 한 라운드가 끝나기 전에 origin 부분에서 시작될 수 있다. 이 복제의 다중 개시는 세균 증식이 복제 1라운드를 마치는 것보다 단시간에 일어날 수 있다.

반보존적 복제(Semiconservative Replication)각 딸 염색체는 한 부모 DNA 털과 한 개의 새로 합성된 상호보완적 털 모양을 갖고 있다. 그래서 복제가 semicon servative(반보존적)라 불리는 것이다. 즉 부모의 그늘은 보존할 수 있지만 더 이상 함께 있을 수 없다는 것을 의미한다. 왜냐하면 부모들의 쇠사슬은 아래 그림처럼 새로 합성된 쇠사슬과 조합되기 때문이다.

DNA 규명(DNA 이중선 해체) 복제는 부모 DNA 분리와 복제 분기점에 앞서 헬릭스(helix)의 해명이 필요하다. Helicase(나선효소, 헬기케이스)가 DNA 줄기를 분리해 부모 듀플렉스를 푼다. 단일 사슬 결합 단백질(Single-strand binding protein)은 이들 사슬이 다시 결합하는 것을 막고 단일 사슬 DNA를 끊는 효소의 작용을 막는다. Topo isomerase(토포이소마레이즈. 인산디에스테르 결합 phosphodiester bonds를 쪼개어 이를 재결합시키는 효소)는 parental duplex의 초나선(super coiling)을 풀어준다. DNA gyrase는 세균 세포에서 주요 토포이소메레즈이다.

부모 DNA 분리와 분리에 관여하는 단백질 https://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19

DNA polymerase Action(DNA 중합성효소작용) DNA합성을 촉매하는 효소는 DNA Polymerase로 알려져 있다. 라. coli는 3가지 DNA 중 합성효소를 가지고 있다. (Pol1, Pol2, Pol3) Pol3는 주요 복제효소이다.박테리아 DNA Polymerase 기능 Polymerase 기능 Exonuclease activity (핵산 외부 가수분해효소) Pol1-RNAprimer 제거 후 공간을 채움-DNA 회복(repair)-RNase H와의 접합에서 RNAprimer 제거 5′-to-3’과 3’to-5’Pol-2′

새로 들어오는 뉴클레오티드는 이 주형 사슬의 상호 보완적인 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성한다. 다음으로 에스터 결합이 새로 들어오는 뉴클레오티드의 첫 번째 (혹은 α) 5′-phosphate와 성장 중 사슬 말단의 자유 3′-hydroxyl group 사이에 형성된다. 피로인산(Pyrophosphate)은 방출된다. 피로인산의 방출과 (뉴클레오티드 β와γ인산에서 형성된 것) 피로인산가수분해효소에 의한 지속적인 분열은 중합반응을 일으키는 에너지를 제공한다.

복제 동안에 새로운 사의 합성을 촉매하는 DNA중합효소 효소는 프로시저(지속성)로 불리는 특징이 있다. 이들은 “process”를 계속하는 사이에 분리되거나 각 뉴클레오티드가 추가되어 재조립되기보다 parental template strand에 결합한 채로 남아 있다. 그 결과 합성은 processive하지 않는 효소와 있을 때보다 더 빨리 일어난다.

염기결합 오류(Base-pairing errors) Polymerase3 E.coli에서 복제효소 Pol3은 교정이나 편집기능을 수행하기도 한다. 이 효소는 폴리메라아제 활성뿐만 아니라 3′-to-5′ 엑소뉴크라아제(핵산 외부 가수분해효소) 활성을 가지고 있다. 만약 성장 중인 사슬 말단의 뉴클레오타이드가 주형사슬과 올바르게 염기쌍이 되면 Pol3이 이 뉴클레오타이드를 연장이 지속되기 전에 제거한다. 이 교정(proofreading) 활성은 대부분의 염기조합 오류가 발생할 때마다 제거한다.100만 개 중 단 1개의 염기쌍 정도가 최종 DNA에서 잘못 매칭된다. 그 때문에, 비율은 약 10-6 정도가 된다. 만약 이 교정이 효소에서 실험적으로 제거될 경우 오류 비율은 10-3까지 증가한다고 한다.

복제 후 다른 메커니즘이 교정 단계를 벗어난 이 잘못 매칭된 염기를 대체하기 때문에 DNA 복제의 정확도는 매우 높다. 교정과 복제 후 잘못된 부분복구 이 두 과정은 전반적인 오류 정도를 10-10으로 낮추고 이는 10억 개의 염기조합 중 한 가지 오류 확률보다 낮다는 것이다.

RNA Primer Requirement RNA프라이머의 역할 DNA중합효소 는 새로운 근의 합성을 시작할 수 없다. 이것은 기능을 위해 자유 3′-PH의 공급이 필요하다. 그래서 이 free 3-OH를 공급하기 위해 프라이머가 필요하다. 이 프라이머는 RNA oligonucleotide이다.이 플라이마는 DNA 거푸집 사슬을 복사하는 RNA polymerase에 의해 5′-to-3′ 방향으로 합성된다. DNA중합효소는 처음에 deoxyribo nucleotide를 프라이머의 3′-hydroxyl기에 붙이고 deoxyribo nucleotide를 성장중인 3′-말단에 붙인다.

복제 분기점(Replication Fork)의 부모님은 모두 동시에 복제 분기점 방향으로 복사되지만 복제 분기점은 알려지지 않은 DNA 중합 효소의 활성과 함께 5′-to-3′ 방향으로만 사슬을 만들 수 있는 약간 이해하기 어려운 부분이다. 부모의 흐름이 서로에 비해 반대 방향으로 진행되기 때문에 합성은 일주형 흐름의 분기점을 “향해” 5′-to-3″ 방향으로 진행해야 하며, 다른 주형 흐름의 분기점에서 “멀어짐” 5′-to-3″ 방향으로 진행되어야 한다.

Okazaki라는 사람이 이 딜레마를 풀었는데, 그는 “leading strand(거푸집의 쇠사슬)”라 불리는 한 가닥의 합성을 보여줌으로써 이 쇠사슬이 분기점으로 향하는 5′-3’방향으로 계속된다는 것을 보여주었다. (*이 leading strand 거푸집사슬은 앞서 계속 제시한 template strand 거푸집사슬과는 다르다) 또 하나의 근은 lagging strand(지연사슬)라 불리며, 이는 일관성 없이 짧은 파편과 합성된다. 밑그림을 보자. 이 파편은 Okazaki라고 불리며, 이는 5′-3′ (분기점에서 멀어짐)으로 나아가지만, 다시 합쳐져 전반적으로는 합성이 복제 분기점 방향으로 진행된다.

출처 Marks ‘ basic medical b iochemistry 5th edition FIGURE 13 . 5

DNA Ligase (DNA 리거제) 복제가 진행됨에 따라 RNA 프라이머는 (아마) DNA Polymerase1(=Pol 1,5′-3’exonuclease activity를 사용한다) 작용과 RNase H(DNA-RNA 하이브리드에서 RNA 제거하는 효소)의 결합으로 Okazaki. Pol 1은 프라이머 제거로 생긴 공간을 채운다. 그런데 DNA polymerase는 두 개의 폴리뉴클레오티드 사슬에 끼일 수 없기 때문에 추가적인 효소 DNA ligase의 도움이 필요하다. 파편 끝의 3′-hydroxyl group이 그 다음 파편인 5′-말단 인산기와 연결된다.

DNA ligase의 작용.두 개의 폴리뉴클레오티드사슬(하나는 free 3′-OH 기, 다른 하나는 free 5′-phosphate 기)이 DNA ligase에 의해 합쳐져 phosphodiester bond를 형성한다. ( 출처 Marks ‘ medical biochemistry 5th edition FIGURE 13 . 6 )